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Masterarbeit (wissenschaftlich) - Detailansicht
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Bibliografische Informationen
 Molekulare Mechanismen Neurodegenerativer Erkrankungen  
 Es wurde gezeigt, dass Proteine der hnRNP-Proteinfamilie, welche Arginin- und Glycin-reiche Sequenzregionen haben (RG/RGG-Motive), von Protein Arginin Methyltransferasen methyliert werden. Bei dem Protein Fused–in-Sarcoma (FUS) reguliert die Methylierung des RGG-Motivs die Interaktion mit dem Karyopherin Transportin-1 und dadurch den Kernimport. Bei einer Misregulation dieser post-translationalen Modifikation kommt es zur Mislokalisation der Proteine und in weiterer Folge zur Bildung von zytoplasmatischen Proteinaggregaten, was ein zentrales Merkmal der neurodegenerativen Erkrankungen Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Frontotemporale Dementia (FTD) ist. Außerdem ist auch eine große Anzahl anderer RG/RGG Proteine in anderen neurodegenerativen Erkrankungen und proliferativen Krebserkrankungen involviert.

Die Hypothese dieser Studie ist, dass eine verringerte Arginin-Methylierung zu neurodegenerativen Erkrankungen führt, wohingegen eine Hypermethylierung für die Entstehung von Krebserkrankungen verantwortlich ist. Das Ziel dieser Arbeit ist die Aufklärung von molekularen Schlüsselmechanismen, welche zu neurodegenerativen Erkrankungen führen. Dafür werden regulatorische Mechanismen des Kernimports von RG/RGG Proteinen der hnRNP Familie anhand des Beispiels CIRP untersucht. Um das Wissen über die regulatorische Arginin-Methylierung und damit potentiell assoziierte Biomarker in Patienten nachweisen zu können, wurde ein Protokoll für die NMR-basierte metabolische Phänotypisierung erarbeitet und an Proben einer Patientenkohorte getestet, um Metabolitenprofile zu untersuchen bzw. Metaboliten der Argininmethylierung nachzuweisen.

Eine Kombination aus biochemischen und strukturbiologischen Techniken wird in dieser Arbeit verwendet, um humane Proteinkonstrukte (CIRP und Transportin-1) heterolog in Escherichia coli BL21 DE3 Zellen zu exprimieren und mittels immobilisierter Metallionenaffinitätschromatographie und Größenausschlusschromatographie aufgereinigt. Bindungsstudien von CIRP-, als auch FUS-Proteinkonstrukten an Transportin-1 werden mit isothermer Titrationskalorimetrie und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR – nuclear magnetic resonance) durchgeführt. In weiterer Folge wurde NMR-Metabolomik getestet, um Metaboliten des Arginin-Methylierungsstoffwechsels, als auch Biomarker generell zu identifizieren und zu quantifizieren. Diese metabolische Phänotypisierung wurde erweitert mit Festphasenextraktion und optimierten NMR Pulssequenzen, um die Anzahl an Metaboliten, die identifiziert werden können, zu erhöhen.

Viele dieser RGG-Proteine sind involviert in einer Vielzahl an Krankheiten wie Neurodegeneration und Krebs. Das RGG Motiv und die SY Region von CIRP wurden als Transportin-1 bindende Elemente identifiziert, wodurch sie im Kernimport von CIRP eine zentrale Rolle spielen. Da die CIRP SY-Region auch ein potentielles Ziel für Proteinkinasen ist, könnte eine Phosphorylierung eine weitere wichtige PTM sein, die den Kernimport reguliert. Das RGG-Motiv von CIRP zeigt eine stärkere Bindung an Transportin-1 als die SY Region, weshalb diese Bindung auch bei der Analyse des Volllängenkonstrukts dominiert. Die Analyse von Patientenproben mittels NMR-basierter metabolischer Phänotypisierung zeigte, dass Metaboliten aus dem Argininmethylierungsstoffwechsel neben einer Vielzahl an anderen Metaboliten in Bioflüssigkeiten identifiziert werden können. In einem Demonstrationsversuch konnte anhand einer Patientengruppe gezeigt werden, dass die etablierten Protokolle gut geeignet sind, um Änderungen in Metaboliten und damit Biomarker zu identifizieren.
Ein Wechselspiel der Phosphorylierung von CIRP-SY und der Methylierung von CIRP-RGG könnte die Affinität von CIRP zu Transportin-1 regulieren. Weitere Analysen von den Bioflüssigkeiten könnten detektierbare Unterschiede in Metaboliten des Methylierungsstoffwechsels identifizieren, was ein wichtiges Diagnostikkriterium werden könnte.  
 NMR, Metabolomics, Proteine, Neurodegeneration  
 
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Autorinnen*Autoren / Co-Autorinnen*Co-Autoren
  Stryeck, Sarah; BSc
Betreuende Einrichtung / Studium
  Lehrstuhl für Molekularbiologie und Biochemie
 UF 066 866 Masterstudium; Biochemie und Molekulare Biomedizin  
Betreuung / Beurteilung
  Madl, Tobias; Assoz. Prof. Mag. Dr.rer.nat.