| Einleitung: Das maligne Melanom ist der sechsthäufigste maligne Tumor der westlichen Welt mit einer steigenden Inzidenzrate von 4-6% pro Jahr. Etwa 50% aller Melanome zeigen eine V600E-Mutation des für das BRAF-Protein kodierenden Protoonkogens. Patienten mit einem Melanom, die diese Mutation aufweisen, können im Sinne einer „targeted therapy“ mittels BRAF-Inhibitoren (z.B. Vemurafenib oder Dabrafenib) im metastasierenden Stadium effektiver therapiert werden als mit einer Chemotherapie (z.B. Dacarbazin). Die klinische Relevanz dieser Forschung begründet sich im Bedarf einer personalisierten Medikation für betroffene Patienten. Ziel war es, den Anteil der Zellen mit einer V600E-Mutation in Melanomengeweben zu quantifizieren.
Methoden: 62 Melanomproben wurden mithilfe eines mutationsspezifischen Antikörpers (VE1), welcher BRAF-V600E-mutierte Zellen mit hoher Spezifität und Sensitivität darstellt, immunhistochemisch analysiert. Nach händischer Optimierung der immunhistochemischen Färbemethoden wurde der Farbstoff Nova Red für alle Proben zur Färbung verwendet; 31 der Proben wurden zusätzlich mit dem Farbstoff Vina Green gefärbt. Anschließend wurden von den immunhistochemisch gefärbten Schnitten mittels eines in ein Mikroskop (Aperio XT ScanScope) integrierten Kamerasystems Aufnahmen gemacht. Diese wurden sowohl visuell als auch mittels der Bildanalysesoftware Aperio ImageScope mit dem Ziel, einen Algorithmus für die Quantifizierung der BRAF-Expression im Melanomgewebe zu erstellen, ausgewertet. Um die Ergebnisse der beschriebenen Färbemethode zu validieren, wurden 13 der immunhistochemisch gefärbten Proben mit der Restriktionsverdauungsmethode auf das Vorhandensein einer BRAF-V600E-Mutation getestet. Weiters wurden die Ergebnisse mit bestehenden Genotypisierungsdaten, ermittelt durch MALDI-TOF (Goldstandard), verglichen.
Ergebnisse: Mit MALDI-TOF zeigten sich 18 der 62 (29%) Proben positiv auf die BRAF-V600E-Mutation. Die visuelle Auswertung der Immunhistochemie ergab, dass 15 der 62 (24%) Proben mit dem Farbstoff Nova Red und 2 der 31 (6%) mit Vina Green positiv waren. Verglichen mit der MALDI-TOF-Methode (als Goldstandard) zeigte die Nova Red-Auswertung eine Sensitivität von 66,7% und eine Spezifität von 93,1%. Cohens Kappa betrug 0,63 (95% CI, 0,41 - 0,85) mit einem p-Wert von 0,000000589. Die Vina Green-Auswertung hatte eine Sensitivität von 100% und eine Spezifität von 33,3%. Cohens Kappa betrug 0,45 (95% CI, 0,02 - 0,87) mit einem p-Wert 0,00284. Die computergestützte Auswertung der immunhistochemischen Färbungen zeigte höhere Medianwerte der Positivität (Prozentzahl der positiven Pixel im gesamten ausgewerteten Feld einer Probe) bei Proben mit einer V600E-Mutation am BRAF-Gen als bei Proben ohne Mutation.
Schlussfolgerung: Sowohl die immunhistochemische Färbemethode mit visueller bzw. mit computergestützter Auswertung als auch die Restriktionsverdauungsmethode war der genetischen Methode mit MALDI-TOF im Nachweis von BRAF-V600E-Positivität unterlegen. Daher bleibt MALDI-TOF der Goldstandard im Nachweis von BRAF-V600E-Positivität als Voraussetzung für eine BRAF-Inhibitor-Therapie. |
