| Hintergrund: Patienten mit familiärem kolorektalen Krebssyndrom Typ X (FCRCX) erfüllen die klinischen Kriterien für nicht-polypösen Darmkrebs (HNPCC), die kausalen prädisponierenden Gene sind jedoch unbekannt. Diese Doktorarbeit hat zum Ziel die genetische Ursache zu ergründen.
Methoden: Genkoppelungsanalyse, Exom-Sequenzierung (WES) und direkte Re-Sequenzierung wurden verwendet, um das vermeintliche Prädispositionsgen in einer großen österreichischen Familie zu identifizieren. Die kodierenden Regionen dieses Gens wurden anschließend in 53 Patienten mit FCRCX aus Österreich, Deutschland und den USA mittels direkter Sequenzierung untersucht und die Genotypenhäufigkeit mit 1138 österreichischen krebsfreien Kontrollprobanden mittels 5'-Exonuklease-Untersuchung verglichen. Um kooperierende Mutationen zu finden, wurde eine Tiefensequenzierung der kolorektalen Karzinomen (CRCs) der Träger aus der Familie durchgeführt. HCT 116-Zellen wurden mit Wildtyp- und mutierten cDNAs mittels Lipofectamine transfiziert, die entstehende Wirkung auf Signalwege und Proliferation durch Immunblot bzw. 7-AAD/BrdU-Durchflusszytometrie bestimmt.
Resultate: Die neue p.Val78Met (c.232G>A) Keimbahnvariante in SEMA4A wurde als potentiell ursächliche Mutation, die mit allen CRCs segregiert und mit extrakolorektalen Neoplasien assoziiert ist, identifiziert. Die Untersuchung der Patienten mit FCRCX führte zur Identifizierung von zwei weiteren Keimbahnvarianten (p.Gly484Ala; p.S326F) und dem Einzelbasenpolymorphismus (SNP) p.Pro682Ser in sechs von 48 (12.5%) deutschen und österreichischen Individuen. Pro682Ser war stark mit dem FCRCX-Phänotyp assoziiert (Prävalenz von heterozygoten Trägern in Kontrollen 2.1% [24/1138], P=0.0009) und zeigte ein erhöhtes Risiko für CRC (OR 6.79, 95% CI 2.63 to 17.52). Somatisch entstandene Mutationen in bekannten CRC-Genen wurden in TP53, APC, KRAS und PIK3CA als mögliche kooperierende Ereignisse in CRCs von SEMA4A-V78M-Trägern gefunden. Verglichen mit dem Wildtypprotein zeigte die SEMA4A-V78M-Mutante eine signifikant höhere Aktivierung der Signalwege MAPK/Erk und PI3K/Akt sowie eine gesteigerte Proliferation in SEMA4A armen HCT 116-Zellen.
Fazit: Keimbahnvarianten in SEMA4A prädisponieren zu FCRCX. |
