| Micro-RNA (miRNA, miR) sind 19-25 Nukleotide kurze, endogene nicht-codierende RNS-(Ribonukleinsäure) Moleküle, die die Genexpression auf post-transkriptionaler Ebene regulieren. miR-451 wird in Mikropartikeln aus cerebrospinaler Flüssigkeit von Patienten mit Schädelhirntrauma exprimiert, jedoch nicht in Mikropartikeln aus der Cerebrospinalflüssigkeit von Kontrollen ohne Schädelhirntrauma. Die Aufnahme von Mikropartikeln, die aus der cerebrospinalen Flüssigkeit von Patienten mit Schädelhirntrauma stammen, durch humane Zellen in vitro resultierte in einer miR-451 spezifischen verminderten Expression von FGFR1 (Fibroblast growth factor receptor 1) und CD133 (Prominin-1). Sowohl FGFR1 als auch CD133 sind mit verletzungsbedingt induzierter adulter Neurogenese, der Neubildung von Nervenzellen im adulten Gehirn, assoziiert. Ein erhöhter zerebraler Wert von miR-451 könnte somit frühe Prozesse der adulten Neurogenese regulieren und mit einer reiferen neuronalen Phase gekoppelt sein. Die Hypothese und Basis der vorliegenden Arbeit ist die Annahme, dass miR-451 eine wesentliche Rolle in der Proliferation und Induktion der neuronalen Differenzierung von humanen Zellen in vitro spielt. Das Ziel dieser Dissertation ist es, die Funktion von miR-451 während der Differenzierung zu neuronalen Zellen zu analysieren.
Dazu wurden humane NT2 Zellen (Ntera-2 cl.D1) mit einem lentiviralen Vektor, der die Sequenz von miR-451 enthält, transduziert, wodurch die Überexprimierung von miR-451 erreicht wurde. Die neuronale Differenzierung dieser Zellen und Zellen, die mit einem Kontrollvektor transduziert wurden, wurde durch die 2-wöchige Zugabe von Retinsäure in einer frei schwimmenden Aggregatkultur (Bildung von Neurosphären) und der anschließenden Behandlung der später adhärenten Neurosphären mit Mitoseinhibitor bewirkt. Die Zellen wurden zu verschiedenen Differenzierungszeitpunkten mit diversen Methoden analysiert (Immunfluoreszenz (Visualisierung der neuronalen Differenzierung), CellIQ (Beobachtung der sich bildenden Zellausläufer), qRT-PCR (Expression der verschiedenen Differenzierungsmarker und Zielgene), Western Blot (Validierung der potentiellen Zielgene)).
miR-451 überexprimierende undifferenzierte Zellen zeigten eine verzögerte Spaltschließung beim Scratch-Assay und morphologische Veränderungen während der Migration (signifikante Zellelongation). Während der Differenzierung von nicht transduzierten NT2 Zellen kommt es zu einer gesteigerten Expression von miR-451, was möglicherweise auf eine Beteiligung von miR-451 in der neuronalen Differenzierung von NT2 Zellen hindeutet. Bei der Differenzierung von miR-451 überexprimierenden NT2 Zellen kommt es im Vergleich zu den transduzierten Kontrollzellen zu einer signifikant veränderten Expression neuronaler Differenzierungsmarker, einer beschleunigten morphologischen Veränderung zum neuronalen Phänotyp und zu einem erhöhten Ausmaß des Neuritenauswuchses. Das spricht für eine Beteiligung von miR-451 in Reifungsprozessen der neuronalen Differenzierung in vitro.
Weiters wurden in der vorliegenden Arbeit AKT1, CAB39, RAB14, TSC1 und YWHAZ als Zielgene von miR-451 im Kontext der neuronal Differenzierung in vitro mittels qRT-PCR validiert.
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