Loading
Medizinische Universität Graz   Hilfe

Meine Abschlussarbeiten - Publikationen

Abschlussarbeit(en) (Universitätslehrgang) - Detailansicht
Wichtigste Meldungen anzeigenMeldungsfenster schließen
Bibliografische Informationen
 16S-rDNA-Sequenzierung von bakteriellen Erregern auf Illumina MiniSeq: Primeroptimierung für humanpathogene Bakterien und kurze Leselängen  
 Die Identifizierung bakterieller Erreger wird gewöhnlich, wenn eine Kultivierung nicht möglich ist ‒ z. B. bei Formalin fixiertem Paraffin eingebettetem (FFPE) Gewebe ‒ mittels 16S-rDNA-Sequenzierung durchgeführt. Die hierfür verwendeten Primer, die in hoch konservierten Regionen des 16S-rRNA Gens binden, sollten für human¬pathogene Arten optimiert sein (was bisher nicht der Fall war). Außerdem sollten sie für die vorliegende Arbeit so gewählt werden, dass eine 16S-rDNA-Sequenzierung auch mit dem vorhandenen Illumina MiniSeq (Leselänge nur 2x150 bp) möglich war.
Es wurden daher 16S-rDNA-Sequenzen nahezu sämtlicher (2363) humanpathogener Bakterienarten aus NCBI heruntergeladen, aligniert, Sequenzierartefakte nach Möglichkeit eliminiert und unter Berücksichtigung von Konservierungsgrad der Primerbindungsstellen, Amplikonlänge, Schmelztemperatur und optimaler Annealingtemperatur für humanpathogene Bakterien optimierte Primer entworfen. Anschließend wurden die Primer sowohl mit der Sequenzdatenbank human¬pathogener Bakterien wie auch mit der 'SILVA ribosomal RNA gene database' abgeglichen.
Der Sequenzvergleich mit humaner 18S- und 12S-rDNA (zytoplasmatischer bzw. mitochondrialer Ribosomen) zeigt, dass mit den vorgestellten Primerpaaren lediglich eine Coamplifikation von 18S-rDNA in V3 sowie 12S-rDNA in V3-V4 gut möglich ist (üblicherweise nur wenn keine bakterielle DNA in der Probe enthalten ist).
Die Funktionalität der neuen Primer wurde zunächst an Bakterienkulturen erfolgreich getestet, die generierten Sequenzen mit QIIME2 und BLAST ausgewertet und mit der massenspektrometrisch erfolgten Determination der Bakterien verglichen.
Insgesamt passen alle Primer für 75,4% der humanpathogenen Arten exakt. Die Passgenauigkeit der einzelnen Primer beträgt 92,3-98,77% bzw. 96,74-99,96% (1 mismatch allowed). Bei Verwendung aller vorgeschlagener Primerpaare sollten sämtliche humanpathogene Arten amplifizierbar sein.
Ein Vergleich mit der 'SILVA ribosomal RNA gene database' zeigt, dass die Primer/Primerpaare im Mittel für 3,5 bzw. 6,4 % mehr humanpathogene Arten exakt passen.
Es traten je nach verwendetem Primerpaar in sehr unterschiedlicher Frequenz (0,11 - 90,17%) Artefakte auf Grund von Primerdimeren, Primerpaardimeren oder primer hairpins auf (relativ kurze Sequenzen, deren fehlendes Signal am Ende auf Grund der Illumina 2-dye chemistry als poly-G string gelesen wird).
Abschließend wurde die homologe small-subunit-rRNA ursprünglicher Eukaryoten in den Datensatz bakterieller 16S-rRNA integriert. Der resultierende phylogenetische Stammbaum der Bacteria stützt eine Abstammung der Mitochondrien von einem gemeinsamen Vorfahren mit den Rickettsiales. Eine enge Verwandtschaft der Mitochondrien als Endosymbionten mit den Rickettsiales als obligat intrazelluläre (Endo-)Parasiten erscheint aus evolutionärer Sicht durchaus plausibel.  
 16S-rRNA; kleine ribosomale Untereinheit; humanpathogene Bakterien; 12S-rRNA; mitochondriale DNA; Endosymbiontentheorie; Rickettsiales  
 
 –  
Autorinnen*Autoren / Co-Autorinnen*Co-Autoren
  Pühringer, Franz; Dr.med.univ.
Betreuende Einrichtung / Studium
  Diagnostik & Forschungsinstitut für Humangenetik
 UO 992 730 Universitätslehrgang; MSc Medizinische Genetik  
Betreuung / Beurteilung
  Kashofer, Karl; Priv.-Doz. Mag. Dr.phil.