Medizinische Universität Graz

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Bibliografische Informationen

Titel

Entwicklung und Anwendung fluoreszierender protein-basierter Sensoren zur Bestimmung des Proteinimports in Mitochondrien

Kurzfassung

Fast alle Proteine der Mitochondrien werden im Erbgut des Zellkerns kodiert, weshalb diese Proteine nach bzw. schon während ihrer Bildung im Zytosol in die Mitochondrien importiert werden müssen. Daher ist ein effizienter Proteinimport in die Mitochondrien essentiell für die vielen wichtigen Funktionen dieser Zellorganellen. Die Fähigkeit der Mitochondrien, Proteine zu importieren, kann jedoch eingeschränkt sein, wodurch es zu einer Akkumulation dieser Proteine im Zytosol oder Kern kommen kann. Die Erfassung des mitochondrialen Proteinimports (MPI) und seiner Defekte kann sowohl zellulären Stress als auch Fitness anzeigen. In dieser Arbeit werden hochauflösenden Sensoren, welche auf der Basis von fluoreszierendem Protein (FP) aufgebaut sind, zur Visualisierung des MPI und seiner Defekte entwickelt, charakterisiert und angewandt. Die Anwendung der ersten Klasse von MPI-Sensoren, bei denen FPs mit verschiedenen mitochondrialen Targeting-Sequenzen (MTS) fusioniert wurden, ergab, dass Krebszellen konstant und sehr effizient sehr hohe Mengen von Proteinen mit optimiertem MTS in die Mitochondrien importieren können. Zusätzlich deuten unsere Daten auf einen kotranslationalen Import solcher Proteine in Mitochondrien hin, der die hohe Kapazität von Mitochondrien zur Aufnahme von kernkodierten Proteinen erklären könnte. Dieser Ansatz erwies sich auch als geeignet, um die Bedeutung des Membranpotentials der Inneren Mitochondrien-Membran für den Proteinimport zu erforschen. Bei Depolarisation der Mitochondrien kam es akut zu fehllokalisierten Proteinen außerhalb der Organellen. In einem weiteren Versuch entwickelten wir neuartige zwei- und dreiteilige Sensoren, bei denen Split-FP-Technologien (scSplit-FP) und dimerisierungsabhängige FP-Technologien (ddFP) zur Anwendung kamen. Die auf dem scSplit-FP-Ansatz basierende Generierung des mitochondrial Sirtuin4-Tripartite-Abundance-Reporter (Mito-STAR) ermöglicht die quantitative Untersuchung der subzellulären Verteilung von Sirtuin 4 (Sirt4), einem mitochondrialen Matrixprotein, das Signalwege und Zellstoffwechseländerungen bei bestimmten Zellstressarten auslöst. Unsere Daten zeigten, dass Sirt4 bei Zellstress verstärkt auch im Zytosol und Zellkern von Krebszellen vorkommen kann. Mithilfe der ddFP-Technologie haben wir eine weitere Klasse von FP-basierten Sensoren für die Untersuchung von MPI entwickelt. Diese sogenannten Mitochondrial Protein Import Analyzer (Mito-PRIMA). ermöglichen die Erkennung von Störungen in der MPI-Maschinerie, indem dabei ein Fluoreszenzsignal durch FP Dimerisierung erzeugt wird. Die Nutzung von Mito-PRIMA ergab, dass die Stimulierung der Transkription eine Überlastung der MPI-Maschinerie in Krebszellen auslösen kann. Insgesamt unterstreichen die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse, dass die neuentwickelten Sensoren und Protokolle genaue Untersuchungen des Proteinimportes in Mitochondrien ermöglichen, wodurch Defekte und deren Ursachen dieses wichtigen zellulären Vorgangs bei unterschiedlichen Erkrankungen besser erforscht werden können.

Schlagwörter

Mitochondrien, Proteinimport, Sensoren, fluoreszierende Proteine

Anzahl Seiten

Publikationsjahr

2020

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