Medizinische Universität Graz

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Bibliografische Informationen

Titel

Untersuchung von lipidvermittelter TRPC-Signalisierung durch Licht

Kurzfassung

Einleitung: TRPC3 Kanäle haben durch ihre Bedeutung in erregbaren und nicht erregbaren Zellen und ihrem einzigartigen Aktivierungsmechanismus, viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Die Entschlüsselung des Prinzips der Lipiderkennung durch TRPC-Kanäle und die Klärung ihrer exakten Rolle in nativen Zellen erfordert die Entwicklung spezifischer Strategien. Die Photopharmakologie als neuartige und hochpräzise Methode zur Manipulation von Signalmolekülen eröffnet die Möglichkeit zu einer solch spezifischen Kontrolle von TRPC Kanälen. Diese Technik bietet zwei prinzipielle Ansätze die zur optische Kontrolle von TRPC3-Kanälen geeignet sind: “caged” und “photochrome” second messenger. Die Lichtgesteuerte Aktivierung von Liganden kann mechanistische Einblicke in die Signalfunktion von TRPC3 liefern und ihre Nutzung als therapeutische Zielstruktur vorantreiben.
Ziel: Die Entwicklung spezifischer photopharmakologischer Werkzeuge zur Manipulation der TRPC3-Kanalaktivität in vitro und in vivo.
Materialien und Methoden: In dieser Arbeit haben wir photoschaltbare Liganden auf ihre Eignung zur Kontrolle von TRPC3-Kanälen durch Licht untersucht. Wir kombinierten elektrophysiologische Methoden mit Ca2+ “Imaging”-Techniken, um die Aktivität von TRPC3 während der Photoaktivierung mittels Lipid- und Nicht-Lipid-Aktivatoren, nachzuweisen. Neben einem Standard Expressionssystem (HEK293) wurden zwei weitere Zellmodelle (Endothelzellen und Neuronen) mit endogen exprimierten TRPC-Kanälen zur Charakterisierung dieser photopharmakologischen Werkzeuge verwendet.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: “Lipid-uncaging” bewirkte Ca2+ -Transienten in TRPC3-transfizierten Zellen. Allerdings wurde dabei eine “uncaging”-induzierte Leitfähigkeit als ein unerwartetes
UV-beleuchtungsabhängiges Artefakt identifiziert. Dieser Nebeneffekt war durch die Käfigstruktur (Coumarin) erzeugt und berut vermutlich auf einer direkten Wirkung auf die LIpidmembran. Alternativ haben wir zu umgeheung dieser Probleme photochrome Liganden entwicklet. Photochrome Gruppen wie Azobenzol ermöglichen die Kontrolle des Konformationszustands durch lichtabhängige cis-trans-Isomerisierung und damit der biologischen Aktivität eines Liganden. Der Einbau von Azobenzol in Lipide wurde als eine Alternative zur “uncaging”-Strategie eingesetzt. Ein Mutagenesescreening, das durch Homologie-Modellierung von TRPC3 in Kombination mit photosensitiven Lipiden durchgeführt wurde, ermöglichte die Identifizierung einer essentiellen Lipid-Protein-Interaktionsstelle innerhalb des Porenkomplexes von TRPC3. Um eine noch spezifischere Kontrolle über endogene Kanäle zu erreichen, synthetisierten wir ein photochromes Benzimidazol OptoBI-1, ein Derivat des TRPC3/6-Agonisten (GSK1702934A) Die Lichtstimulation von OptoBI-1 ermöglichte eine präzise Kontrolle über TRPC-Kanäle in Endothelzellen und Neuronen. Zusammenfassend liefert diese Arbeit eine Grundlage für die Entwicklung zukünftiger Strategien zur Erforschung von TRPC-Kanälen in vitro und in vivo.

Schlagwörter

TRPC, Lipid, Ca2+ Signalisierung, Photopharmakologie

Anzahl Seiten

Publikationsjahr

2020

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