| Langfristige Echtzeitaufnahmen von Zellpopulationen können sich als sehr nützlich erweisen um die Viabilität, Proliferation und Migration zu bestimmen. Fortschritte innerhalb der letzten Jahrzehnte haben die Beobachtung von Zellkulturen - potenziell kombiniert mit Floureszenz - über Tage ermöglicht, indem Zellinkubatoren mit Mikroskopen kombiniert wurden.
Ich habe mikroskopische Verfahren zur Bestimmung der Viabilität, Proliferation und Migration an einem Zeiss Axiovert Observer Mikroskop etabliert und es mit dem innovativen, speziell für diese Anwendungen entwickelten Cell-IQ System verglichen. Drei Zelllinien wurden mit diesen Techniken untersucht, die endothelialen EA.hy926, die Zervix-karzinom HeLa und die pankreatischen beta (INS-1) Zellen. Während die INS-1 Zellen Serum- oder Nährstoffentzug nicht allzu lang tolerierten, konnten sowohl die EA.hy926 als auch die HeLa Zellen für bis zu 4 Tage in Entbehrung überleben. Dabei trat eine Wachstumseinschränkung auf, welche jederzeit durch Hinzugabe der jeweiligen limitierten Resource rückgängig gemacht werden konnte.
Stabiler Knockdown des Mitochondrial Ca2+ Uniporter (MCU) oder Annexin A5 in HeLa Zellen hatten keinen Einfluss auf die Viabilität oder Proliferation. Transienter Knockdown von Mitochondrial Ca2+ Uptake 1 (MICU1) hatte keinen Einfluss auf die Migration der EA.hy926 Zellen, weder im Scratch noch im Cell Exclusion Zone Insert Assay.
Schließlich korrelierte ich intrazelluläre Signale von Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Sensoren mit der Viabilität und Proliferation von Zellen. Ca2+ wurde aus dem Lumen des Endoplasmatischen Reticulums (ER) entlassen, was von einem Anstieg des ATP in dieser Organelle begleitet wurde, wie kürzlich von uns gezeigt wurde.
Ich konnte zeigen, dass solche HeLa Zellen mit einer schnelleren Proliferation einen signifikant erhöhten Ca2+-bezogenen [ATP]ER Anstieg im Vergleich zu langsamer proliferierenden Zellen aufweisen. Außerdem hatten HeLa Zellen unter Glukoseentzug einen drastisch reduzierten Ca2+-bezogenen [ATP]ER Anstieg innerhalb von Minuten, welcher sich von alleine nach etwa 4 Stunden erholte.
In dieser Zeitspanne konnte ich keinen Unterschied in der Viabilität feststellen.
In meiner Diplomarbeit habe ich verschiedende Analysetechniken verglichen: die Intensitäts- und die morphologische Analyse für die Viabilität, die Konfluenz- und Zellzahlbestimmung für die Proliferation und die manuelle oder die automatische Analyse für die Migration.
Zellen konnten semiautomatisch anhand ihrer Morphologie erfolgreich unterschieden werden, z.B. in viable, tote oder sich teilende. Meine Ergebnisse zeigen, dass sich alle diese Techniken für High-Throughput-Analysen eignen. |
