| Einleitung
Die Knochenmarks–Nische besitzt ein einzigartiges Milieu mit einer Vielzahl an unterschiedlichen Zelltypen. Eine dieser Zellen ist die, für die Hämatopoese zuständige, hämatopoetische Stammzelle (HSC), welche in dieser Nische, die notwendigen Bedingungen für ihre Proliferation und Differenzierung vorfindet. Eine weitere Stammzelle, die mesenchymale Stammzelle (MSC), ist nicht nur eine Vorläuferzelle für multiple Zelltypen, sondern spielt auch eine wichtige Rolle in der Entwicklung der HSC. Erste Versuche, HSCs ex vivo zu kultivieren, führten aufgrund ihrer komplexen Millieuanforderungen der Notwendigkeit verschiedener Zell-Zell Interaktionen zu ernüchternden Ergebnissen. Ko-Kultivierungsexperimente versuchten, besagte Problematiken zu überkommen, die Zugabe der Zytokine erfolgte jedoch extern, was sich als teuer und unphysiologisch herausstellte.
Methoden
Wir modifizierten genetisch humane mesenchymalen Stammzelltypen (MSC-hTERT und HS27a) um die Zytokine FLT3L, SCF, TPO und IL-6 über zu exprimieren. Fluoreszenzmarker beinhaltende cDNA-Konstrukte (FLT3L_SCF_BFP und TPO_IL-6_BFP) wurden mittels CRISPR/Cas9-vermittelter homologer Rekombination (HDR) in sogenannte „safe harbor“ Sequenzen (HBB oder AAVS1) eingebracht, wobei rekombinante adenoassoziierte Viren (rAAVs) als „template DNA“ Vektoren verwendet wurden. Nach einer, mittels in-out PCR, durchgeführten knock-in Kontrolle wurden bei erfolgreicher Einbringung, die Zytokinspiegel durch einen ELISA-Test gemessen. Anschließend wurden humane mesenchymale Stammzellen, welche Zytokine exprimierten, entweder mit Zytokin-abhängigen akuten myeloischen Leukämiezelllinien (AML) oder aus Nabelschnurblut stammenden hämatopoetischen Stammzellen kultiviert. Das Zellwachstum der getesteten Zelllinien wurde mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Weiters wurde die CD34+ Teilpopulation und die koloniebildende Eigenschaften bestimmt.
Ergebnisse
Insgesamt konnten wir 8 Klone (vier für TPO_IL-6_BFP, einen für FLT3L_SCF_BFP und drei, welche beide Konstrukte beinhalteten) für die MSC-hTERT und 14 Klone für die HS27a Zelllinie (sechs für TPO_IL-6_BFP, fünf für FLT3L_SCF_BFP und vier, beide Konstrukte beinhaltete) konstruieren. Vier MSC-hTERT Klone und neun HS27a Klone produzierten signifikante Mengen der getesteten Zytokine (p<0,05).
Die Kokulturen mit Zytokine exprimierenden Zellen führte zu einer signifikanten Expansion von Leukämiezelllinien im Vergleich zu nicht modifizierten Wildtyp-Zellen (MSC-KI:MSC-WT: p<0,001) oder Monokultur-Bedingungen (MSC-KI:neg. ctrl: p<0,001). Auch nicht modifizierte Wildtyp-Stromazellen verstärkten das Zellwachstum im Vergleich zu Monokultur-Bedingungen (MSC-WT:neg. ctrl.: p<0,001). Die Expansion von HSPCs, evaluiert durch die Gesamtzahl der CD34 positiven Zellen, war in Kokulturen mit Zytokin-exprimierenden Stromazellen signifikant erhöht (MSC-KI:neg. ctrl: p<0,001), während der Prozentsatz der CD34+ Zellen (p = 0,051) und die Gesamtzahl der Kolonien nicht signifikant von den ausgeschiedenen Zytokinen beeinflusst wurden.
Conclusio
Durch die Nutzung des CRISPR/Cas9-Systems zur präzisen Konstruktion von Zytokin exprimierenden Stromazellen sollte diese Studie die lang bestehenden Herausforderungen der in vitro Kultivierung von AML und HSPCs überkommen. Die erfolgreiche Einführung des Expressionskonstrukts in MSCs führte zu ausreichender Produktion der humanen Zytokine FLT3L, SCF, TPO und IL-6.
Kokulturexperimente mit Konstrukt–beinhaltenden MSCs zeigten deutliche Vorteile in Bezug auf Zellzahlen und Expansionsrate und verstärken somit die Annahme, dass MSCs eine entscheidende Rolle in der Knochenmarknische spielen und die wichtige Rolle dieser essenziellen Zytokine hervorheben.
Unter Berücksichtigung der mit der Studie einhergehenden Limitationen, einschließlich nicht physiologisch aktivierter Zytokingene und der hohen Heterogenität der kleinen Probenmenge, ermöglicht diese Arbeit die Bedeutung der MSCs in der HSC–Entwicklung hervorzuheben. Die CRISPR/Cas9 vermittelte Einbringung der Zytokine bietet vielversprechende Möglichkeiten für zukünftige Studien, welche auch erforderlich sind, um genauere Einblicke in die molekularen Mechanismen der MSC-HSC Interaktion zu geben und physiologischere HSC Langzeitkulturen zu ermöglichen.
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