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Meine Abschlussarbeiten - Publikationen

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Bibliografische Informationen
 Validierung eines Next-Generation-Sequencing Assays zum Nachweis von EGFR Mutationen in zellfreier zirkulierender Tumor-DNA  
 Lungenkrebs ist die häufigste krebsbedingte Todesursache weltweit. Die Prognose ist vorwiegend vom Stadium des Lungenkrebses bei der Erstdiagnose abhängig. Eine Früherkennung ist daher von großer Bedeutung. Nach wie vor ist eine Biopsie des Tumorgewebes für die histologische und molekularpathologische Diagnose der Goldstandard. Ca. 15% der nicht-kleinzelligen Lungenkarzinome (engl. non-small cell lung carcinoma, NSCLC) weisen eine aktivierende Mutation im epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) auf und können daher mit zielgerichteten Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs) therapiert werden. Nach einem initialen Ansprechen kommt es jedoch bei einem Teil der Patienten innerhalb von 1 bis 2 Jahren zu einer Therapieresistenz und einer Tumorprogression. In etwa 50% der Fälle ist eine Mutation im Codon 790 des EGFR Gens (T790M) Ursache für diese erworbene Resistenz. Patienten mit einer nachgewiesenen EGFR T790M Mutation können mit einem TKI der dritten Generation weiterbehandelt werden. Der Nachweis der T790M Mutation aus zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA) aus Blutplasma stellt eine schonende, nicht-invasive Alternative zur Rebiopsie des Tumors dar und kann daher zum Therapiemonitoring von Lungenkrebspatienten verwendet werden. Aufgrund der oft sehr niedrigen Tumorfraktion in NSCLC-Patienten wird für den Nachweis der T790M Mutationen üblicherweise die hochauflösende droplet digital PCR (ddPCR) verwendet, jedoch kommen immer mehr Next Generation Sequencing (NGS) Verfahren zum Einsatz.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob der Reveal ctDNA™ 28 Next Generation Sequencing (NGS) Assay eine vergleichbare Sensitivität und Spezifität zur droplet digital PCR (ddPCR) aufweist und zum nicht-invasiven Therapiemonitoring aus ctDNA von progredienten Lungenkrebspatienten geeignet ist. Im ersten Schritt wurde der NGS Assays vollständig mit kommerziell erhältlichen Referenzmaterial validiert. Anschließend wurden im Rahmen der Routinediagnostik 28 Plasmaproben von 18 Patienten mittels NGS Assay und ddPCR analysiert und die Ergebnisse miteinander verglichen.
Durch die Validierung des Assays mit Referenzmaterial konnte bei einer Variantenallelfrequenz (VAF) von 0,5% und einem DNA Input von mindestens 22 ng eine Sensitivität von 96% und eine Spezifität von 100% nachgewiesen werden. Die Ergebnisse stimmen mit den Angaben des Herstellers und einer weiteren Studie der Fa. SeraCare überein. Die Vergleichsstudie der Patientenproben ergab eine Konkordanz von 91% zwischen NGS und ddPCR, wobei die ddPCR eine höhere Sensitivität bei der EGFR T790M Mutation und eine vergleichbare Sensitivität bei den Exon 19 Deletionen und bei der L858R Mutation aufwies.
Aus den Ergebnissen kann nun abgeleitet werden, dass bei einem Input von mindestens 22 ng zellfreier zirkulierender DNA (cfDNA) aus 5 ml Plasma eine Variantenallelfrequenz (VAF) von 0,5% (11 Kopien/5ml Plasma (2 Kopien/ml)) detektiert werden kann und daher zum Therapiemonitoring von Patienten unter TKI Therapie verwendet werden kann. Idealerweise sollte in der klinischen Routinediagnostik eine Kombination aus NGS (mit breiter Abdeckung einer Vielzahl von Genomloci) und ddPCR (mit dem gezielten hochsensitiven Nachweis spezifischer Mutationen) verwendet werden.


 
 Lungenkrebs; Next Generation Sequencing; NGS; ddPCR; Mutation; cfDNA; ctDNA; liquid biopsy; zellfreie Tumor DNA; zirkulierende Tumor DNA; T790M; Archer  
 
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 Genetik
Autorinnen*Autoren / Co-Autorinnen*Co-Autoren
  Stitz, Regina; BSc
Betreuende Einrichtung / Studium
  Medizinische Universität Graz
 UO 992 730 Universitätslehrgang; MSc Medizinische Genetik  
Betreuung / Beurteilung
  Heitzer, Ellen; Assoz. Prof. Mag. Dr.rer.nat.