| Lungenkrebs ist nach wie vor eine der tödlichsten Krebserkrankungen und aktuell befinden sich mehrere zielgerichtete Therapien in Entwicklung bzw. Erprobung um die Überlebensrate von Patienten zu verbessern. Das Wissen um die genetischen Veränderungen, welche das Fortschreiten der Tumorerkrankung verursachen oder begünstigen, wird über die gesamte Erkrankungsdauer dringend benötigt um rechtzeitig mit zielgerichteten Therapien auf angreifbare Mutationen reagieren zu können.
Nach wie vor basiert die Detektion von relevanten Mutationen hauptsächlich auf Tumorbiopsien deren invasiver Charakter eine hohe Belastung für die Patienten darstellt. Ein neuer Zugang zur Mutationsdetektion ist die sogenannte „flüssige Biopsie“. Hierbei handelt es sich u.a. um die Analyse von zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA) aus dem Blut. Durch den minimal-invasiven Charakter der Blutabnahme könnte diese Methode eine schnelle und verträglichere Variante zu herkömmlichen Gewebsbiopsien ermöglichen.
Das Hauptaugenmerk der vorliegenden Diplomarbeit war es, verschiedene Fragestellungen bezüglich einer möglichst robusten Mutationsdetektion von Tumor-DNA aus dem Blutplasma zu behandeln. Besonderer Fokus lag dabei auf den präanalytischen Methoden, wie z.B. der Auswahl von Blutröhrchen und dem Vergleich verschiedener Methoden zur Extraktion von Plasma DNA. Die untersuchten Parameter waren die Ausbeute, Größenverteilung und der Tumorgehalt der Plasma-DNA um somit Standards für weitere Arbeiten zu etablieren. Außerdem wurde ein Gen-Panel von QIAGEN mit einer Krebszelllinie getestet um seine Auflösungsgrenze zur Mutationsdetektion festzulegen. Im Anschluss wurde das Panel an sechs Lungenkrebsproben getestet.
Zu diesem Zweck wurde Blut von zwei gesunden Kontrollpersonen und zwei metastasierten Kolonkarzinompatienten gesammelt und die frei-zirkulierende DNA (cfDNA) mittels eines manuellen, vollautomatischen und eines Vakuum-basierten Verfahrens extrahiert. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Blutröhrchen gefunden werden. Bezüglich der DNA Ausbeute war die Vakuum-basierte Extraktion den anderen Verfahren überlegen.
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Die Auflösungsgrenze des Gen-Panels von QIAGEN wurde mittels Verdünnungsreihe der Krebszelllinie HCT116 festgelegt. Dabei wurde gezeigt, dass eine Mutationsdetektion unter einer mutierten Allelfrequenz (MAF) von 5% nicht möglich war. Nach der Sequenzierung und manuellen Variantenauswahl der sechs Lungenkrebsproben wurden 51 Varianten identifiziert, welche allerdings nicht mit einer unabhängigen Methode bestätigt wurden.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die drei getesteten Blutröhrchen gleich gut in der Konservierung der frei-zirkulierenden DNA abschnitten. Die Vakuum-basierte Extraktion erwies sich hinsichtlich der DNA Ausbeute als das beste Verfahren und bietet sich daher als bevorzugte Methode zur Extraktion an, vor allem wenn man den geringen Anteil der ctDNA im Plasma in Betracht zieht.
Die etablierte Auflösungsgrenze des Gen-Panels von QIAGEN von circa 5% MAF hat sich als nicht ausreichend erwiesen um Mutationen aus dem Plasma sensitiv genug nachzuweisen wenn man bedenkt, dass der Anteil von ctDNA nur 0.01% betragen kann. Dies bestätigte sich nach der Austestung des Gen-Panels mit den Lungenkrebsproben, wobei eine hohe Anzahl an Varianten auffiel und bestimmte Mutationen in mehreren Proben zu sehen waren. Dies könnte für eine hohe falsch-positiv Rate oder Artefakte sprechen. |
