| Da eosinophile Granulozyten nur einen geringen Anteil der peripheren Leukozyten ausmachen, ist ihre Isolierung und Anreicherung nur zu einem gewissen Grad möglich. Um die Erforschung der komplexen Funktionen eosinophiler Granulozyten zu erleichtern, ist die Optimierung neuer Kultivierungsmethoden, die die Generierung einer großen Anzahl von differenzierten Eosinophilen gewährleisten, notwendig. In dieser Studie testeten wir zwei verschiedene Zellkultursysteme: einerseits arbeiteten wir mit Maus-Knochenmarks-Vorläuferzellen, die zu Eosinophilen differenziert wurden (BmEos), und andererseits mit einer humanen eosinophilen Leukämie Zelllinie, den EoL-1 Zellen. Um die Funktionalität der BmEos zu bestätigen, wurden die Effekte zweier Chemoattractants, Eotaxin und PGD2, auf die ausdifferenzierten BmEos und auf frisch isolierte humane Eosinophile überprüft. Bei den EoL-1 Zellen untersuchten wir die Expression der beiden PGD2 Rezeptoren, CRTH2 und DP, und überprüften ihre Aktivierbarkeit in verschiedenen funktionalen Assays. Zur Differenzierung der BmEos wurde Knochenmark von BALB/c Mäusen isoliert und Vorläuferzellen wurden durch Kultivierung in Zytokin-Medium (FLT3-L und SCF) angereichert. Anschließend wurden diese in IL-5 Medium zu Eosinophilen ausdifferenziert. Für die Differenzierung der BmEos testeten wir Sera (FCS) unterschiedlicher Qualitätsgrade und variierten deren Konzentration, sowie die Menge von IL-5 im Medium. Die Differenzierung der humanen EoL-1 Zelllinie in eosinophile Granulozyten wurde mit Natriumbutyrat induziert. Das verwendete Medium enthielt dabei unterschiedliche Konzentrationen an FCS und IL-5. Die Aktivierbarkeit der nicht-differenzierten und differenzierten Zellen wurde in Chemotaxis- und Calcium-Assays getestet. Mittels Durchflusszytometrie bestimmten wir die Expressionsmuster der CRTH2 und DP Rezeptoren auf den EoL-1 Zellen. Bei unseren Tests fanden wir nur ein Serum, das die Proliferation und Differenzierung großer Mengen von Eosinophilen aus Maus-Knochenmarks-Vorläuferzellen in einem zwölftägigen Kultursystem unterstützte. Die ausdifferenzierten Zellen waren vom eosinophilen Phänotyp und exprimierten den Eosinophilen-Marker Siglec-F. Die Stimulierung mit Eotaxin führte zu einem klaren Anstieg der CD11b Oberflächenexpression, sowohl in den BmEos, als auch in humanen Vollblut-Eosinophilen. Stimulierung mit PGD2 führte jedoch nur in humanen Eosinophilen zu einem Anstieg von CD11b. Ähnliche Ergebnisse ergaben auch die Chemotaxis-Versuche; Eotaxin induzierte sowohl in BmEos als auch in humanen Eosinophilen eine chemotaktische Antwort, PGD2 im Gegensatz führte nur bei humanen Eosinophilen zur Migration. Da wir jedoch mittels Western Blot das Vorhandensein des PGD2 Rezeptors CRTH2 nachweisen konnten, gehen wir davon aus, dass durch die Kultivierung der BmEos in IL-5 der CRTH2 Rezeptor internalisiert bzw. inaktiviert wird und eine Stimulierung mit PGD2 daher nicht mehr möglich ist. Auf der Oberfläche der EoL-1 Zellen konnten wir CRTH2 nachweisen. Die Expression des DP Rezeptors zeigte sich jedoch als inkonsistent. Des Weiteren konnte mit PGD2 eine chemotaktische Migration der EoL-1 Zellen induziert werden. Ein PGD2-vermittelter Anstieg der intrazellulären Kalzium Konzentration wurde hingegen nicht beobachtet. |
