| Hintergrund: Die Pathogenese der akuten Appendizitis, einer entzündlichen Erkrankung des Wurmfortsatzes, ist nach wie vor nicht vollständig geklärt. Der aktuellen Forschungslage zur Folge, scheinen Fusobakterien eine entscheidende Rolle in der Krankheitsentstehung zu tragen. Fusobakterien sind bekannt dafür orale Infektionen zu verursachen. In endodontischen Infektionen konnten neben
Fusobakterien auch vermehrt methanogene Archaeen nachgewiesen werden, was einer symbiotischen Beziehung der beiden Mikroorganismen geschuldet sein könnte. Das Ziel dieser Arbeit war es, ein FISH-Protokoll für Appendixschnitte zu etablieren, um in weiterer Folge die räumliche Verteilung und Zusammensetzung von Bakterien und Archaeen in entzündeten Appendices darzustellen.
Methodik: Es wurden 60 Appendixproben von Kindern, welche aufgrund des Verdachts einer Appendizitis einer Appendektomie an der Universitätsklinik für Kinder- und
Jugendchirurgie Graz unterzogen wurden, verwendet, um daran die Methodik zur Fixierung, Einbettung und rRNA-FISH zu testen.
Ergebnisse: Zur Fixierung der Appendixproben wurde Carnoy’sche Lösung verwendet, welche im Vergleich mit einer Ethanolfixierung in Stuhlsuspensionen eine gleichwertige Erhaltung der Zellintegrität der Mikroorganismen zeigte. Carnoy`sche Lösung konservierte
außerdem in Appendixproben Appendixzellen und die Mukusschicht. Appendixproben wurden in Technovit 8100® eingebettet, da es vor Färbungen nicht aus den Schnitten entfernt werden muss. Zur Gewährleistung der notwendigen
anaeroben Umgebung wurden die Blöcke während der Aushärtung in Vakuumkammern gelagert. Ein Vergleich mehrerer Objektträger und Trockungsmethoden zeigte die beste Adhärenz der Schnitte, nach dreistündigem Trocknen bei 40°C auf SuperFrost™ Objektträgern. In Versuchen mit
Zellsuspensionen war es durch die Permeabilisierung mit Lysozym und Proteinase K und anschließender rRNA-FISH von Mikroorganismen möglich, die mikrobiellen Zellen unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop zu betrachten. Die Übertragung dieser Arbeitsprozesse auf die Appendixschnitte, war trotz mehreren Adaptionsversuchen, nicht erfolgreich und es konnten mittels rRNA-FISH keine
Mikroorganismen in den Appendixproben dargestellt werden. Schlussfolgerung:
Da die Darstellung von Mikroorganismen in den Appendixschnitten durch FISH mit Hilfe der untersuchten Fixierungs,- Einbettungs- und Hybridisierungsmethoden
nicht erfolgreich war sollten weitere Versuche zur Optimierung des Verfahrens unternommen werden. |
