Loading
Medizinische Universität Graz   Hilfe

Meine Abschlussarbeiten - Publikationen

Abschlussarbeit(en) (Universitätslehrgang) - Detailansicht
Wichtigste Meldungen anzeigenMeldungsfenster schließen
Bibliografische Informationen
 Erhöhung der Sensitivität und Genauigkeit der Oxford Nanopore Sequenziertechnologie für den Nachweis und die Quantifizierung von Single und Compound Mutationen in der BCR::ABL1-Tyrosinkinasedomäne  
 Hintergrund: Der Nachweis und die Quantifizierung von Mutationen in der BCR::ABL1 Tyrosinkinasedomäne ist ein wichtiger Marker für die Beurteilung des Ansprechens auf eine Therapie mit Tyrosinkinaseinhibitoren bei Philadelphia-positiven Leukämien. Die Durchführung dieser Analysen kann mit Hilfe der Oxford Nanopore Sequenziertechnologie erfolgen. Diese Methode, im Gegensatz zu Short-Read Sequenzierern, ermöglicht die Analyse langer Sequenzen unabhängig von ihrer Position und Distanz am sequenzierten Abschnitt, sodass Single und Compound Mutationen voneinander unterschieden werden können. Compound Mutationen stellen aufgrund ihrer hohen Resistenz gegenüber Tyrosinkinaseinhibitoren eine Herausforderung dar. Trotz zahlreicher weiterer Vorteile limitiert die erhöhte Fehlerquote die Anwendbarkeit in der Diagnostik.



Methoden: Es wurden Experimente mit dem MinION und dem Adapter Flongle durchgeführt, um die Sensitivität und Genauigkeit dieser Methode zu erhöhen. Einerseits wurden die Sequenzierkits (SQK) - LSK109, LSK110, LSK112 und LSK114 zur Präparation der Library miteinander verglichen. Andererseits wurden Unique Molecular Identifiers (UMIs) getestet. Für die Experimente wurden Plasmide verwendet, die einen Abschnitt des ABL1 Wildtypallels, Single (T315I oder E255V) und/oder Compound Mutationen (T315I/E255V) in einer bekannten Kopienzahl tragen. Zur Sensitivitätsbestimmung wurden Verdünnungsreihen analysiert. Die Sollwerte wurden mit den Istwerten der Nanopore-Sequenzierung verglichen.



Ergebnisse: Beim Vergleich der ausgewerteten Daten der SQK-LSK109, 110 und 112 konnte laut dem durchgeführten statistischen Test (Wilcoxon Signed Rank Test) kein signifikanter Unterschied (p ≤ 0,05) zwischen den Ergebnissen der Kits festgestellt werden. LSK110 und LSK112 waren aber im Durchschnitt besser als LSK109. Mit keinem Kit war die Detektion der Allelfrequenz von 1 % möglich. Zur Auswertung der Daten des SQK-LSK114 wurde aus Kompatibilitätsgründen eine aktuellere bioinformatische Pipeline verwendet. Vorläufige Zwischenergebnisse zeigen, dass die Werte teilweise deutlich über bzw. unter dem Sollwert liegen. Trotz Überschätzung war die Detektion der Allelfrequenz von 1 % möglich. Die bioinformatische Auswertung der Daten, die bei der Verwendung von UMIs generiert wurden, ist noch ausständig.



Interpretation: Zusammengefasst liefert diese Arbeit Informationen zur Durchführung von Sequenzierungen zum Nachweis von Punktmutationen in der BCR::ABL1 Tyrosinkinasedomäne. Es besteht die Möglichkeit, diese Anwendung auf andere Themengebiete, wie die Analyse klinisch/therapierelevanter Punktmutationen in anderen Genen, zu adaptieren. Zusätzlich dient diese Arbeit als Grundlage zur Weiterentwicklung der LSK114 Chemie und der Verwendung von UMIs.

 
 Chronische Myeloische Leukämie BCR::ABL1 Tyrosinkinasedomäne Punktmutationen Oxford Nanopore Technologie Sensitivität Genauigkeit  
 
 –  
 Genetik
Autorinnen*Autoren / Co-Autorinnen*Co-Autoren
  Holzinger, Sandra; BSc
Betreuende Einrichtung / Studium
  Medizinische Universität Graz
 UO 992 730 Universitätslehrgang; MSc Medizinische Genetik  
Betreuung / Beurteilung
  Petek, Erwin; Ao.Univ.-Prof. Mag. Dr. Dr.