| In den letzten Jahren wurden neue Methoden in der Routinediagnostik der Molekulargenetik etabliert, die es erlauben, große Anzahlen an Proben auf einmal zu sequenzieren und zu analysieren. Der Vorteil dieser neuen Methoden der Hochdurchsatzsequenzierung besteht in den geringeren Kosten und der schnelleren Abarbeitung . Zudem erlaubt die Qualität der Daten eine umfassendere Auswertung. Mit dem höheren Probenumfang der Analysen steigt jedoch das Risiko für Probenverwechslungen oder -kontaminationen, vor allem, wenn die Analyse nicht oder nur teilautomatisiert abläuft. Die bisher in unserem Labor durchgeführten Methoden, um eine solche Verwechslung oder Kontamination zu identifizieren, entsprechen nicht mehr den neusten Standards. Im Rahmen dieser Masterarbeit soll deshalb eine robuste und sichere Methode etabliert werden, die gut mit den Routine-Abläufen der molekulargenetischen Diagnostik vereinbar und kostensparend ist, und eine möglichst einfache Auswertung ermöglicht. Diese Methode soll den Patient*innen und auch dem Labor eine hohe Sicherheit und einen hohen Qualitätsstandard bieten.
Es wird eine Single Nucleotid Polymorphism (SNP)-ID-Analyse aus EDTA-Blut implementiert, durch die Probenverwechslungen oder -kontaminationen im Rahmen von NGS-Analysen ab der DNA-Isolierung sicher identifiziert werden können. Bei den SNP handelt es sich um hochpolymorphe Varianten, die es erlauben, Individuen eindeutig voneinander zu unterscheiden, wodurch eine sehr zuverlässige Identifikation der Probe gewährleistet werden kann. Diese SNP werden parallel und idealerweise aus der Primärprobe (EDTA-Blut) und der daraus isolierten DNA bestimmt. Durch den Vergleich der SNP-Profile aus Blut- und zugehöriger DNA-Probe kann eine Probenverwechslung nahezu sicher ausgeschlossen werden (mit Ausnahme von eineiigen Zwillingen).
In der vorliegenden Arbeit werden die möglichen Zeitpunkte der Probenverwechslung beschrieben und bisher verwendete Methoden zur Überprüfung einer Probenverwechslung erläutert. Die SNP-ID-Analyse wird mittels Sanger-Sequenzierung und dem SureDirect Blood PCR Kit (Agilent) und einer anschließenden Library Preparation durchgeführt. In Zusammenarbeit mit der Firma Twist Bioscience werden außerdem zur Etablierung des Produkts 'Twist Human Sample ID Kit' sowohl das α- als auch das β-Kit auf deren Durchführbarkeit getestet.
Abstract
With the introduction of NGS analysis into routine diagnostics in molecular human genetics, it is possible to sequence and analyze large numbers of samples simultaneously.
The advantages besides the high throughput are lower costs and faster processing, but also the quality of the data allows a more profound analyses. However, the higher sample turnover can also lead to an increased risk for sample mix-ups or contamination, especially if the analysis is not or only partially automated.
The methods used so far in the laboratory to identify potential mix-ups or contamination no longer meet the newest standards. In the context of this master thesis, therefore, a new, robust method is to be established, which is well compatible with the routine diagnostics and cost-effective. In addition, a simple evaluation is desired. This method should offer the patient and the laboratory a high level of safety and a high-quality standard.
A single nucleotide polymorphism (SNP) ID analysis from EDTA blood will be implemented, by which sample mix-ups or contaminations can be reliably identified in the context of NGS analyses from the point of DNA isolation onwards. SNPs are highly polymorphic variants that allow individuals to be uniquely identified, making samples distinguishable from one another. These SNPs are determined in parallel from the primary sample (EDTA blood) and the isolated DNA. By comparing the SNP profiles from the blood sample and the corresponding DNA sample, sample mix-ups can be ruled out with high certainty.
In this thesis, the possible time points of sample mix-up are described, and previously used methods to detect sample mix-ups are illustrated. SNP-ID analysis is performed using Sanger sequencing and the Agilent SureDirect Blood PCR Kit (NGS). Furthermore, in collaboration with Twist Bioscience, both the α- and β-version of the kit 'Twist Human Sample ID Kit' will be tested.
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