| Mit der zunehmenden Anzahl der mittlerweile verfügbaren prädiktiven Biomarker wird das klinische Vorgehen bei Patienten mit Krebserkrankungen immer mehr von der genauen Beobachtung der Tumor-Genotypen abhängig. In Zuge dieses Projekts versuchten wir festzustellen, ob aus dem peripheren Blut von Krebspatienten Tumor-spezifische Kopienzahl-Veränderungen nachzuweisen sind. Schließlich waren wir in der Lage, eine Größenverteilung der im Blut zirkulierenden Plasma-DNA zu identifizieren und den Anteil der mutierten Plasma-DNA mittels Deep-Sequencing und ultra-sensitiven Mutations-Detektions-Verfahren, z.B. BEAMing, zu bestimmen. Bei der Analyse der Plasma-DNA von 32 Patienten, die an einem Kolonkarzinom im Stadium IV leiden, zeigte sich, dass ein Teil der Patienten (34.4%) eine biphasische Verteilung der Plasma-DNA-Fragmente beinhaltete, welcher mit einer erhöhten Anzahl an zirkulierenden Tumor-Zellen (CTCs) im Blut und einem höheren Gehalt an im Blut zirkulierender Plasma-DNA korrelierte.
Bei diesen Patienten war die Ermittlung der genom-weiten Tumor-spezifischen Kopienzahl-Veränderung der Plasma-DNA direkt aus dem peripheren Blut der Patienten möglich. Der aktuelle Stand der Kopienzahl-Veränderungen konnte analysiert werde, und das, obwohl die Diagnose des primären Tumors in einigen Fällen schon Jahre zurück lag.
Erstaunlicherweise zeigten, trotz vorangeschrittener Erkrankung, nicht alle Patienten die Freisetzung von messbarer Tumor-DNA ins Blut.
Weiters ergab die Untersuchung der Plasma-DNA von 35 Patienten mit metastasierender Brustkrebs-Erkrankung sehr ähnliche Resultate, was die Spekulation zulässt, dass die von uns etablierte Methode ebenso für andere Tumor-Entitäten anwendbar ist.
In dieser Arbeit wird zum ersten Mal das Vorkommen einer Größenverteilung innerhalb der Plasma-DNA beschrieben, welche einen wichtigen Einfluss auf die Tumor-Diagnose und die Überwachung der Erkrankung haben könnte.
Das Ziel des zweiten Teils dieses Projektes war es, einen adenoviralen-Vektor zur Detektion von zirkulierenden Tumor-Zellen zu entwickeln. Diese zirkulierenden Tumor-Zellen (CTCs), werden vom primären Tumor und von den Metastasen abgegeben, vermischen sich mit den Komponenten des peripheren Blutes und sind aus diesem Grund nur in einer sehr geringen Anzahl vorhanden. Darum stellen sowohl die Detektion als auch die Isolierung der CTCs eine sehr große technische Herausforderung dar. Vor allem, weil es diesen Systemen meist an Spezifität und Sensitivität fehlt. Deshalb entschieden wir uns zur Entwicklung eines Vektors, der alle Zellen des Blutes infiziert, jedoch – mit Hilfe der enthaltenen Expressions-Kassette, bestehend aus hTERT-Promoter und GFP – lediglich Tumor-Zellen zum Leuchten bringt.
Um die Transkriptions-Fähigkeit des entwickelten Adenovirus zu untersuchen transfizierten wir verschiedene Zelllinien mit dem Telomerase-Vektor: Die schwach Telomerase-aktiven Brustkrebszellen MCF 7, die stark Telomerase-aktiven Kolonkarzinom-Zellen HCT 116 und Osteosarkom-Zellen, die keine Telomerase exprimieren.
Die Ergebnisse der Transfektion zeigten, dass der hTERT-GFP-Vektor die GFP-Expression in Telomerase-aktiven Zellen vermitteln kann und daher eine nicht-invasive Möglichkeit zur Überwachung des Tumor-Wachstums und Voranschreiten der Erkrankung bieten könnte.
|
