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Bibliografische Informationen
 Ermitteln eines Schwellenwertes für die Bakteriämiediagnostik mittels Whole Genome Sequencing mit MinION Nanopore  
 Hintergrund:

Blutkulturen stellen noch immer den Goldstandard in der Diagnostik von Blutstrominfektionen dar, obwohl der Diagnoseprozess lange dauert. Aufgrund der hohen Inzidenz von Blutstrominfektionen und der mit ihnen einhergehenden hohen Mortalität und Morbidität wäre eine Verkürzung dieses Diagnoseprozesses von großem Vorteil. Eine frühere Detektion eines Erregers würde frühere gezielte Therapie ermöglichen und das Outcome für Patient*innen vermutlich verbessern. In den letzten Jahren lieferten mehrere Studien vielversprechende Ergebnisse hinsichtlich schnellerer Erregerdiagnostik mittels Whole Genome Sequenzing mit dem MinION Nanopore (Oxford Technologies). Allerdings liegen keine konkreten Daten vor, wie hoch die Konzentration der Erreger im Blut sein muss, um noch detektiert werden zu können. Ziel dieser Arbeit war es einen Schwellenwert zu finden, ab welchem der Nachweis von Staphylococcus aureus, Escherichia coli und Candida albicans im Blut mittels Sequenzierung mit dem MinION Nanopore möglich ist.



Material/Methoden:

Erstellung von gespikten Blutproben mit Staphylococcus aureus, Escherichia coli oder Candida albicans. Dafür wurden drei Verdünnungsreihen mit den jeweiligen Keimen erstellt, um Proben verschiedener Konzentration zum Sequenzieren zur Verfügung zu haben. Die Verdünnungsreihen wurden im Doppelansatz erstellt, ein Ansatz (A) jeweils mit 0.9% NaCl Lösung als Trägerlösung, der zweite Ansatz (B) mit Lithium-Heparin-Blut als Trägerlösung.

Die im Anschluss sequenzierten Verdünnungsstufen enthielten jeweils 1,5 x 105 CFU/ml, 1,5 x 104 CFU/ml, 1,5 x 103 CFU/ml, 1,5 x 102 CFU/ml, 1,5 x 10 CFU/ml und 1,5 CFU/ml. Eine Kontrolle der Konzentrationen der Proben erfolgte durch einen Ausstrich jeder einzelnen Probe des A-Ansatzes auf Schafblut-Agar. Anschließend wurde die DNA aus den Proben des B-Ansatzes extrahiert. Die extrahierte DNA wurde nach Erstellung der Library mit dem MinION Nanopore mittels Whole Genome Sequencing sequenziert. Basecalling der Daten erfolgte mit Hilfe von Dorado-0.8.2 Software, für eine weitere Analyse der Sequenzierergebnisse wurde die qiime2-Metagenome Distribution 2024.10 Plattform und der Dem Epi2me Labs wf-metagenomics Nexflow-Workflow herangezogen.



Ergebnisse:

Die von den Kontrollplatten abgelesene Keimzahl der ausgestrichenen Proben stimmte bei allen weiterverwendeten Proben mit der erwarteten Keimzahl überein.

Im durchgeführten Sequenzierlauf ließ sich E. coli in allen 22 sequenzierten Proben inclusive der Negativproben und der NTC („no template control“) Probe nachweisen. Ein Nachweis von S. aureus und C. albicans war in keiner der Proben möglich.



Conclusio:

Die Ermittlung des Schwellenwertes war aufgrund einer wahrscheinlichen Kontamination der Proben im Workflow und der fehlenden Detektion der eingebrachten Pathogene nicht möglich. Erneute Versuche mit besonderem Augenmerk auf Kontaminationsfreiheit und Verminderung der Dominanz der menschlichen DNA in den Proben durch „host depletion“ oder „adaptive sampling“ sind notwendig um die eingebrachten Organismen in einer ausreichenden Häufigkeit zu Samplen um einen Schwellenwert ermitteln zu können.

 
   
 
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Autorinnen*Autoren / Co-Autorinnen*Co-Autoren
  Hofer, Barbara
Betreuende Einrichtung / Studium
  Universitätsklinik für Innere Medizin
 UO 202 Humanmedizin  
Betreuung / Beurteilung
  Zollner-Schwetz, Ines; Assoz. Prof. Priv.-Doz. Dr.med.univ.
  Krause, Robert; Univ.-Prof. Dr.med.univ.