| Stickstoffmonoxid (NO) ist ein kleines Radikal, welches viele wichtige Zellfunktionen in Säu-gern, Bakterien und Pflanzen steuert. Trotz der Existenz einer Vielzahl von Verfahren zur NO Detektion in vivo und in vitro stellte sich heraus, dass die Echtzeitmessung von NO auf der Ebene einzelner Zellen sehr herausfordernd ist. Vor kurzem haben wir die Palette der NO-Indikatoren durch Einführung der geNOps-Technologie erweitert, welche eine neue Ära der NO-Bioimaging eröffnen könnte. Das Ziel dieser Arbeit war es, die geNOps weiterzuentwi-ckeln, zu charakterisieren und Anwendungen zu erproben, um unser aktuelles Wissen über die komplexe Entstehung, Diffusion und den Abbau des NO-Radikals zu erweitern. Zu diesem Zweck wurde eine stabile Zelllinie, welche die grünen G-geNOps exprimiert, entwickelt daran und erfolgreich die NO-Freisetzung verschiedener NO-Donoren getestet. Darüber hinaus ermöglicht die geNOps-Technology durch in das Lumen von Mitochondrien gerichtete Sen-soren die Visualisierung von lokalen NO-Signalen innerhalb dieses Organells. Mithilfe von Mehrkanalaufnahmen ermöglichen die geNOps erstmals NO-Konzentrationsveränderungen in Reaktion auf Ca2+-Mobilisierung gleichzeitig in Mitochondrien und im Zytosol von En-dothelzellen zu messen. Weiters wurde die geNOps-Technologie in HEK-Zellen angewendet, welche nNOS, eNOS oder iNOS stabil exprimieren. Die erlangten Daten zeigen deutlich, dass die Ca2+-abhängigen NO-Signale in eNOS- und nNOS-exprimierenden HEK-Zellen sich wesent-lich hinsichtlich ihrer Amplitude und dem kinetischen Verhalten unterscheiden. Interessan-terweise zeigten nNOS-exprimierenden Zellen auf einen Stimulus hin einen sehr raschen NO-Anstieg innerhalb von Sekunden, während die NO-Bildung in eNOS-exprimierenden Zellen viel langsamer war von statten ging und mehrere Minuten beanspruchte. Ferner wurde ein ratiometrischer Sensor zur Visualisierung von NO-Signalen in iNOS-exprimieren HEK-Zellen entwickelt. Dieser sogenannte CR-geNOp erlaubt es, hohe basale NO-Spiegel in iNOS-exprimierenden HEK Zellen zu detektieren. Außerdem sind diese neuen Sensoren dafür ein-gesetzt worden, um die Arginin-Abhängigkeit der NO-Erzeugung dynamisch zu visualisieren. Diese Experimente zeigen, dass die geNOps hervorragend geeignete Werkzeuge sind, die es erlauben, die Entstehung und den Abbau von NO in Einzelzell-Modelsystemen unter ver-schiedenen Ansatzweisen in Echtzeit erlauben. |
