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Medizinische Universität Graz    

Meine Abschlussarbeiten - Publikationen

Dissertation - Detailansicht
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Bibliografische Informationen
 Die Entwicklung von genetisch kodierten Biosensoren der nächsten Generation für die Lebendzellmikroskopie zellulärer Signalübertragung und des Stoffwechsels  
 Genetisch kodierte fluoreszierende Biosensoren ermöglichen die Visualisierung metabolischer Vorgänge in lebenden Zellen. Ziel dieser Dissertation war es, dieses Methodenspektrum durch die Entwicklung von Reportern der nächsten Generation für die Aktivität der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK), die duale Ca2+-AMPK-Detektion, die Signalübertragung des mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) und die Aufzeichnung der Glukoseversorgung zu erweitern.

AMPK koordiniert zelluläre Antworten auf Energiestress und stellt daher einen zentralen Regulator für die Untersuchung metabolischer Signalprozesse dar. AMPK-SPARK wurde als phasenseparationsbasierter Reporter für Kinaseaktivität entwickelt, der AMPK-Aktivierung in die Entstehung heller fluoreszierender Cluster übersetzt. Dieser kontrastreiche und reversible Readout ermöglichte es, endogene AMPK-abhängige Aktivität in verschiedenen Zelltypen auf Einzelzellebene abzubilden und unter unterschiedlichen metabolischen und pharmakologischen Perturbationen zu visualisieren. Eine phospho-defiziente AMPK(T>A)-SPARK-Kontrolle zeigte eine stark reduzierte Clusterbildung und stützte damit die phosphorylierungsabhängige Reporteraktivierung. AMPK-SPARK zeigte außerdem zelltypabhängige basale Aktivität und variable Antworten zwischen benachbarten Zellen, welche den Wert des Reporters für die Einzelzellanalyse der AMPK-Signalübertragung unterstreicht.

GCaMP-AMPK-SPARK wurde als Proof of Principle für ein duales Reporterdesign generiert, das einen auf einem einzelnen Fluoreszenzprotein basierenden Biosensor mit einem phasenseparationsbasierten Reporter für Kinaseaktivität kombiniert. Durch die Integration von GCaMP6f in die AMPK-SPARK-Architektur konnten Ca2+-Dynamiken und AMPK-abhängige Clusterbildung mittels Einkanal-Fluoreszenzmikroskopie erfasst werden. Dies reduzierte die spektrale Belastung, vermied die Koexpression separater Biosensoren und offenbarte eine bislang unbekannte Heterogenität in der Ca2+-AMPK-Kopplung während Ca2+-mobilisierender Stimulation.

mTORC1 stellt eine komplementäre nährstoffsensitive Signalachse dar, die mit zellulärem Wachstum, Metabolismus und AMPK-abhängiger Regulation verknüpft ist. Um das SPARK-Konzept auf die mTORC1-Signalübertragung zu transferieren, wurden Kandidaten-Substratmotive und phospho-bindende Domänen untersucht, was zur Entwicklung eines mTORC1-SPARK-Reporters führte. Dieser Reporter lieferte einen reversiblen clusterbasierten Readout und reagierte auf pharmakologische Modulation der mTORC1-Aktivität, wodurch das Konzept phasenseparationsbasierter Kinase-Reporter auf einen weiteren zentralen metabolischen Signalweg erweitert wurde.

Die Glukoseversorgung von Zellen beeinflusst den zellulären Energiehaushalt und verändert nährstoffabhängige Signalwege. Um die vorangegangene Glukoseverfügbarkeit aufzuzeichnen, wurde ein split-HaloTag-basierter Glukoseaufzeichner entwickelt. Dieser Reporter unterschied zwischen glukosehaltigen und glukosefreien Bedingungen in HeLa-Zellen und reagierte auf die Hemmung des Glukosetransports durch KL11743, was seine Sensitivität gegenüber Änderungen der Glukoseverfügbarkeit stützt. Da die kovalent gebundene HaloTag-Markierung auch nach dem Auswaschen des ungebundenen Farbstoffs erhalten blieb, ermöglicht dieser Ansatz eine spätere Analyse kürzlich erfolgter Glukoseexposition und erweitert das Methodenspektrum von reversibler Aktivitätsbildgebung hin zur Aufzeichnung metabolischer Zustände.

Zusammenfassend erweitern diese Reporter das Spektrum genetisch kodierter Biosensoren zur Untersuchung metabolischer Signalprozesse in lebenden Zellen. Sie vereinen die reversible Bildgebung von Kinaseaktivität, die duale Detektion zellulärer Signale sowie die dauerhafte Aufzeichnung der zellulären Glukoseversorgung und ermöglichen so die Erfassung komplementärer Aspekte der metabolischen Regulation. Diese Arbeit legt die Grundlage für zukünftige High-Content-Imaging-Studien dynamischer Signalprozesse auf Einzelzellebene und in komplexeren zellulären Modellen.  
 genetisch kodierte Biosensoren; Lebendzellmikroskopie; metabolische Signalübertragung; phasenseparationsbasierte Reporter; AMPK; mTORC1; Ca2+-Signalübertragung; Glukoseaufzeichnung  
 
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Autorinnen*Autoren / Co-Autorinnen*Co-Autoren
  Erdoğan, Yusuf Ceyhun; M.Sc.
Betreuende Einrichtung / Studium
  Lehrstuhl für Molekularbiologie und Biochemie
 UO 094 202 PhD-Studium (Doctor of Philosophy); Humanmedizin  
Betreuung / Beurteilung
  Malli, Roland; Assoz. Prof. Priv.-Doz. Mag.pharm. Dr.rer.nat.
  Schindl, Rainer; Assoz. Prof. Priv.-Doz. Dipl.-Ing. Dr.techn.
  Weinberg, Annelie-Martina; Assoz. Prof. Priv.-Doz. Dr.med.
  Cihova, Martina; Dr.