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Medizinische Universität Graz    

Meine Abschlussarbeiten - Publikationen

Dissertation - Detailansicht
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Bibliografische Informationen
  Entschlüsselung der Komplexität intrinsisch ungeordneter Proteinregionen: Untersuchung regulatorischer Mechanismen, die Struktur, Dynamik und Funktion steuern.  
 Aberrante Protein-Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) ist ein lebenswichtiges und weit verbreitetes Phänomen, das der Bildung membranloser Organellen (MLOs) in Zellen zugrunde liegt. Das Vorhandensein von Missense-Mutationen und ein fehlerhafter nukleozytoplsmischer Transport von Arginin-Glycin(-glycin)-reichen (RG/RGG)- Proteinregionen, die in RNA-bindenden Proteinen (RBPs) sehr häufig vorkommen, wurden mit einer fehlregulierten LLPS- und MLO-Bildung in Verbindung gebracht. Dies impliziert ihren Beitrag zum Beginn und Fortschreiten der Neurodegeneration. Die Rekrutierung dieser Regionen durch LLPS und in MLOs wird durch posttranslationale Modifikationen wie Argininmethylierung und Phosphorylierung sowie durch die Bindung an nukleare Importrezeptoren wie Transportin-1 auf komplexe Weise reguliert. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass zahlreiche RBPs Citrullinierungsstellen in ihren ungeordneten Arginin-reichen Regionen enthalten. Die durch kalziumabhängige Protein-Arginin- Deiminasen (PADs) katalysierte Protein-Citrullinierung wandelt Peptidyl-Arginin-Reste in Peptidyl-Citrulline um, was zum Verlust der positiven Ladung führt. Bei Patient*innen mit Multipler Sklerose und verschiedenen Autoimmunerkrankungen, neurodegenerativen Erkrankungen und Krebserkrankungen werden häufig erhöhte Werte der Proteincitrullinierung beobachtet.

Der erste Teil dieser Dissertation zielte darauf ab, die Auswirkungen der PAD4-vermittelten Citrullinierung auf argininreiche Modellregionen zu entschlüsseln, die von FUS, G3BP1 und Nukleoprotein von SARS-CoV-2 abgeleitet sind. Lösungs-NMR-Daten bieten wertvolle Einblicke in die PAD4-vermittelte Citrullinierung in vitro und erleichtern die Zuordnung modifizierter Stellen auf Aminosäure Ebene, die Aufklärung der Citrullinierungskinetik und ihrer Modulation sowie die Ableitung und den Vergleich struktureller und dynamischer Parameter sowohl für ein unmodifiziertes als auch für ein citrulliniertes Protein. Durch eine Kombination aus Lösungs-NMR-Spektroskopie, ITC, DIC und Trübungstests wird gezeigt, dass die Citrullinierung dieser Regionen ihre RNA-induzierte LLPS, RNA-Bindung und Interaktion mit Transportin-1 in vitro reduziert. Darüber hinaus zeigten die gewonnenen Erkenntnisse eine verringerte Stress-Granulat-Assoziation von FUS bei seiner Citrullinierung in semipermeabilisierten Zellen. Darüber hinaus ergab die durchgeführte Untersuchung, dass in vitro keine Demethylierung oder Citrullinierung von Methylargininen durch PAD4 erfolgt. Zusammenfassend legen diese Ergebnisse nahe, dass die Citrullinierung gestörter Arginin-reicher Regionen deren LLPS- und Transportin-1- vermittelten Kernimport reguliert.

Im zweiten Teil dieser Arbeit stelle ich die OptoFluidic Force Induction (OF2i)-Technologie als neuartiges Werkzeug zur Echtzeitüberwachung der Partikelkonzentration und der zeitlichen Entwicklung vor. Dies wird durch unser unvollständiges Verständnis der molekularen Details gestützt, die dem Übergang löslicher Einzelmoleküle in oligomere Komplexe mit flüssigkeitsähnlichen Tröpfcheneigenschaften zugrunde liegen, sowie durch die Mechanismen, die Änderungen in der Größenverteilung von Nanoclustern regulieren, die durch phasentrennende Proteine gebildet werden. In dieser Studie wurde OF2i verwendet, um die DTT-abhängige Aggregation von Insulin zu überwachen und die Rolle von RNA und Salzkonzentration für die RNA-vermittelte Kondensatbildung ungeordneter Regionen aus SARS-CoV-2-Nukleoprotein und FUS zu untersuchen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die OF2i-Technologie als Werkzeug zur quantitativen Charakterisierung der Größenverteilung und Dynamik von Kondensaten und Proteinaggregaten vielversprechend ist.  
 Protein-Flüssig-Flüssig-Phasentrennung; RNA-bindenden Proteinen (RBP); Protein-Citrullinierung; NMR-Spektroskopie; die OptoFluidic Force Induction (OF2i)-Technologie  
 
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Autorinnen*Autoren / Co-Autorinnen*Co-Autoren
  Lenard, Aneta Janina; Lic., MSc
Betreuende Einrichtung / Studium
  Lehrstuhl für Medizinische Chemie
 UO 094 202 PhD-Studium (Doctor of Philosophy); Humanmedizin  
Betreuung / Beurteilung
  Madl, Tobias; Univ.-Prof. Priv.-Doz. Mag. Dr.rer.nat.
  Pertschy, Brigitte; Priv.-Doz. Dr.rer.nat.
  Dormann, Dorothee; Professor Dr.
  Stelzl, Ulrich ; Univ.-Prof. Dipl.-Ing. Dr.rer.nat.